常 　山 , 张雅萍 , 肖光夏 　　 ( 第三军医大学附属西南医院烧伤研究所 , 重庆 400038)

　　提 　要 : 目的 　观察抗白色念珠菌鸡蛋黄抗体 IgY 的稳定性与体外生物学效应。方法 　用水溶法从免疫鸡蛋黄中提取抗白色念珠菌抗体 IgY,ELISA 法检测抗体耐热、耐酸、耐碱的稳定性 , 观察 IgY 抑制白色念珠菌生长和抑制白色念珠菌粘附肠上皮细胞(IEC26)。结果 　 IgY 在巴氏消毒后活性为对照的 61 % , 在 pH 7 1 0 至 3 1 0 酸性环境中活性改变不显著 , 在 pH 7 1 9 ,37 ℃作用 150 min活性仍为对照的 60 % 。 IgY 在 10 mg/ ml 时能明制白色念珠菌生长和对肠上皮细胞的粘附 , 明显降低细胞上清二胺氧化酶(DAO) 释放。结论 　鸡蛋黄抗体 IgY 具有高度稳定性和良好的体外生物学效应。

　　关键词 : 鸡卵黄抗体 ;IgY; 白色念珠菌

　　中图法分类号 : R392.1 　　　 文献标识码 : A

Stability and activities of immunoglobulin Y against Candida albicans IgY in vitro

CHANG Shan , ZHANG Ya 2 ping , XIAO Guang 2 xia (Institute of Burn Research , Southwest Hospital , Third Military Medical University , Chongqing 400038 , China)

　　 Abstract : Objective 　 To observe bio 2 activities and stability of egg immunoglobulin Y (IgY) against Candida albicans . Methods  IgYwaspurified with simple water dilution method (WD) from the eggs yolk of hens immunized with Candida albicans . The stabilities of IgY against acid ,alkali , and heat were measured with ELISA. The effects of IgYon the growth of the bacterium and on its adhesion to cultured intestinal cells(IEC 2

6) were studied. Results 　 The minimal ELISA positive titer of IgYwas 1 ∶ 12 800 and 61 % activity remained after pasteurization. The decrease of IgYactivity was not apparent at pH value from 7 1 0 to 3 1 0 , and 60 % activity remained after 150 min incubation at pH 7 1 9 and 37 ℃ . IgY at 10mg/ ml inhibited the growth of Candida albicans apparently and prevented the adhesion of the bacterium (10 5 cfu/ ml) to cultured intestinal cells and the DAO production. Conclusion 　 Egg yolk IgYagainst Candida albicans possesses its activities against Candida albicans in vitro , and shows sta 2ble properties to heat and acid or alkali environments.

　　 Key words : egg yolk antibody; IgY; Candida albicans

　　免疫鸡蛋黄中含有大量来源于血清的 IgG 抗体( 又名 IgY) , 浓度远高于血清 , 且抗体提取简单 , 来源十分丰富 , 近年来已引起了广大研究人员的兴趣。同时由于 IgY 的分子结构与哺乳类 IgG 的差异使 IgY 的稳定性远高于哺乳类 IgG, 作检测试剂时因不激活补体而比哺乳类 IgG 更精确。本研究用白色念珠菌作为抗原免疫产蛋鸡 , 从蛋黄中提取出抗白色念珠菌 IgY,通过 ELISA 系统检测其耐热、耐酸、耐碱的稳定性 , 同时观察了其抑制白色念珠菌生长和抑制白色念珠菌粘附培养肠上皮细胞的生物学效应 , 为口服应用奠定基础。

1 　材料和方法

1.1 　抗白色念珠菌 IgY 抗体的制备

　　白色念珠菌 (CMCC 44104) 于 0 1 4 % 福尔马林液中灭活后与等体积完全福氏佐剂混合乳化 , 作抗原皮下注射免疫 25 周龄Leghorn 鸡 , 水溶法 ( 蛋黄溶于 9 倍蒸馏水 , 离心取上清并用硫酸钠沉淀IgY)分离纯化 IgY 并透析过滤除菌。紫外光双波长测定 IgY 含量 ,SDS 2 PAGE 电泳检测提取 IgY 的纯度 , 细菌酶标染色观察 IgY 结合白色念珠菌的特异性。

1.2 　 ELISA 检测 IgY 的效价、耐热、耐酸和耐碱稳定性

　　效价 : 将 IgY 从 1 ∶ 200 倍比稀释至 1 ∶ 25 600 检测其效价。耐热 : 将提取 IgY 分别置于 25 、 37 、 50 、 64 、 70 、 75 、 80 ℃孵育 15min 后稀释 5 000 倍进行 ELISA 检测。耐酸 : 将 IgY 分别置于 pH值为 1 ,2 ,3 ,4 ,5 ,6 ,7 酸性环境中 37 ℃孵育 1 h 后稀释 5 000 倍进行 ELISA 检测。耐碱 : 将 IgY 置于 pH 7 1 9 的液体环境中 37 ℃分别孵育 30 、 60 、 90 、 120 、 150 min 后稀释 5 000 倍进行 ELISA 检测。 ELISA 操作步骤 : 白色念珠菌包被 96 孔酶联板后依次加入 : 处理后 IgY 稀释液 ( 每组 6 孔) ;兔抗鸡 IgY 二抗 ; 最后加入邻苯二胺底物显色 30 min , 并用一滴 2 mol/L 硫酸终止反应 , 于490 nm 比色 ( 洗涤液为 0. 05 % Tween 2 20 , PH 7 1 4 0 1 01 mol/LPBS, 阳性对照分别为未加热、酸和碱处理的 IgY 稀释液 , 阴性对照的一抗为未免疫鸡蛋黄提取物 ) 。

1.3 　 IgY 的体外生物学效应

　　 IgY 抑制白色念珠菌生长 : 实验分 2 组 : ①对照组 :3 1 9 × 10 5cfu/ ml 白色念珠菌液于 37 ℃恒温箱中孵育 , 于 6 、 12 、 24 、 32 h ,取样后活菌计数。② IgY 拮抗组 : 将白色念珠菌(31 9 × 10 5 cfu/ml)分别加入 IgY10 、 5 、 2 1 5 mg/ ml , 于 6 、 12 、 24 、 32 h , 取样后活菌计数。

　　 IgY 抑制白色念珠菌粘附培养肠上皮细胞(IEC2 6) : 将含白色念珠菌(5× 10 5 cfu/ ml) 的 DMEM 培养液和含同浓度白色念珠菌的 DMEM 培养液 ( 分别加入 IgY10 、 5 、 2 1 5 mg/ ml 于 37 ℃孵育预处理 30 min) 加入长肠上皮细胞的 96 孔板、每时相点设6 平行孔。观察时相点为 : 加入白色念珠菌后 30 、 60 、 90 、 120 、150 min 。检测指标与方法 : ①粘附细菌数 : 将各个时相点的培养孔去除上清 ,10 mmol/L pH 7. 4 PBS 冲洗培养孔 6 次 ( 每次200 μ l/ 孔) ,然后加入 0 1 25 % 胰蛋白酶2 0 1 02 %EDTA 消化液 100μ l/ 孔消化约 2 min 后接种于沙氏平板培养 72 h 后活菌计数。②上清液二胺氧化酶 (DAO) : 0 1 2 mol/L pH 7 1 2 的 PB 液 1 1 5 ml+ 二甲基联苯胺 50 μ l + 尸胺底物溶液 50 μ l + 样本 250 μ l +辣根过氧化物酶 50 μ l 共计 1 1 9 ml 置于 37 ℃水浴 30 min 于 436nm 比色。检测时相点为粘附后 60 min 。

1.4 　统计学处理

　　采用 t 检验。

2 　结 　果

2.1 　 IgY 特异性、含量和纯度

　　抗白色念珠菌 IgY 对该菌染色阳性而对绿脓杆菌 , 葡萄球菌染色阴性。提取物 IgY 含量平均为 13 1 7 mg/ ml 蛋黄液。将SDS 2 PAGE 电泳凝胶扫描 , 检测 180 × 10 3 带 (IgY) 所占百分比 , 得出 IgY 纯度高达 95 % 。

2.2 　 IgY 效价和稳定性

　　效价 :ELISA 检测出蛋黄 IgY 效价为 1 ∶ 12 800 , 而血清 IgG效价为 1 ∶ 6 400 。耐热 : 以温度为横轴 , 以吸光值为纵轴 , 各温度处理后的吸光值形成一曲线 ( 阳性对照 D 490 值为 1 1 841) , 见图1 。曲线表明在 25 ～ 64 ℃作用后 IgY 的活性下降缓慢 ,64 ℃作用 15 min 后活性为对照的 61 % 。 64 ℃以上作用 15 min 后 IgY活性迅速下降。耐酸 : 以 pH 值为横轴 , 以吸光值为纵轴作一光滑曲线 ( 阳性对照 D 490 值为 0 1 827) , 取阴性对照 D 490 值 0 1 24 为纵轴原点 , 见图 2 。曲线表明 IgY 在 pH 值为 3 以上时其活性改变不大 , 在 pH 值等于 3 时其活性为阳性对照的 70 % 以上 , 但在pH 值为 3 以下时其活性迅速下降。耐碱 : 以时间为横轴 , 以吸光值为纵轴作一光滑曲线 , 取阴性对照 D 490 值 0 1 201 为纵轴原点 , 作用时间为 0 的 D 490 值为阳性对照 D 490 值 , 见图 3 。曲线表明 IgY 在 37 ℃ pH 值 7 1 9 碱性环境中 , 其活性随时间延长下降缓慢 , 在作用时间为 150 min 后其活性接近阳性对照的 60 % 。

2.3 　 IgY 的体外生物学效应

3 　讨论

　　目前 IgY 已经引起广大研究人员的兴趣 , 它主要有三个特性 : ①产量大提取简便 ②具有高度的稳定性和生物效应 ③作为诊断试剂干扰小。

　　本研究应用简便水溶法提取 IgY 的产量高达 13 1 7mg/ ml 蛋黄液 , 纯度高达 95 % ,ELISA 滴度在 1 ∶ 12 800 ,且 IgY 只对白色念珠菌染色阳性 , 对绿脓杆菌和葡萄球菌染色均阴性 , 表明 IgY 来源丰富、纯化简便、具有

较好的特异性 , 是一种具有很高研究和应用价值的抗体。

　　既往有学者采用抗体中和滴度法检测 IgY 的稳定性 , 发现其具有良好的耐酸 , 耐热的理化性质。本研究首次采用敏感的 ELISA 法对 IgY 的稳定性进行系统研究发现 IgY 具有高度的稳定性。 IgY 能耐受巴氏消毒(63

℃ 15 min) , 能耐受 37 ℃、 pH 值 3 以上的酸性环境1 h , 能耐受 37 ℃、 pH 7 1 9 碱性环境 150 min 。 37 ℃、 pH值 3 为通常状况下胃环境 ,37 ℃、 pH 7 1 9 为通常状况下肠道环境 . 因此上述结果表明 IgY 能够通过食品工

业中常用的巴氏消毒法 , 口服后有望能在消化道保持高活性。这种稳定的理化性质对 IgY 作为口服药物和诊断试剂都是十分有利和必要的。 IgY 优良的稳定性可能与其分子结构有关 : IgY 氨基酸及含糖量与哺乳类 IgG 有明显差异 , 其分子结构虽仍然为 2H + 2L , 但它与哺乳类 IgG 最大区别是 IgG 的 Fc 段缺少 IgY 的第2 恒定区(C2 ) 而代之以 IgG 出现了一个铰链区 (Hingeregion) , 而二者的抗原结合部位 F(ab) 尚未发现明显不同。在某些鸡蛋黄中天然含有 IgY 的 △ Fc 片段 , 而这种 △ Fc 片段比完整的 IgY 具有更高的稳定性。上述事实说明 IgY Fc 段结构变化对其活性有明显影响。

　　本实验中 IgY 体外能明显抑制白色念珠菌生长 ,抑制强度和时间与浓度呈量效关系。筛选出的 IgY 浓度 (10 mg/ ml) 能明显抑制细菌生长达 24 h , 而前 24 h正是该菌的对数生长期 , 表明 IgY 具有良好的抑菌效果。同时在该浓度下 IgY 在各时相点能明显抑制白色念珠菌对培养肠上皮细胞的粘附 , 其抑制效果同样具有量效关系。 IgY 抗体抑制白色念珠菌生长主要机制可能为抗体封闭白色念珠菌表面抗原 , 防止白色念珠菌向菌丝体转变 ; 引起凝集等。同时白色念珠菌是典型的粘附致病菌 , 特别在肠道 , 白色念珠菌感染的首要条件是通过菌体表面抗原粘附在肠上皮细胞上 , 因而抗体封闭菌体表面抗原对防止白色念珠菌感染将起到重要作用。二胺氧化酶 (DAO) 是一种控制肠粘膜增殖的细胞质酶 , 主要存在于哺乳动物肠上皮细胞内。肠上皮细胞受损时 , 其细胞内 DAO 下降 , 而上清 DAO 明显升高。因此 DAO 已成为反映肠上皮细胞因缺血和感染而受损的重要敏感指标。本实验应用 IgY 处理白色念珠菌后 , 在粘附高峰明显降低了肠上皮细胞 DAO的释放 , 保护了细胞免受白色念珠菌的破坏。 IgY 抑制白色念珠菌生长、抑制其粘附肠上皮细胞的结果表明该抗体不仅具有良好的稳定性和特异性 , 还具有高

度的生物学活性和高度结合抗原的能力。

　　目前已成功提取出抗蛋白质、病毒、细菌的 IgY,并发现其具有良好的抗病毒抗细菌的生物学效应 , 用于口服防治肠道病原体已取得良好效果。本研究制备出抗白色念珠菌 IgY, 发现该抗体产量高 , 稳定性极好 , 具有很好的生物学效应 , 作为口服药物或食品添加剂预防和治疗病原性腹泻和肠源性感染将具有广阔的前景。

参考文献 :

[1] Akita E M, Nakai S. Comparision of four purification methods for the pro 2duction of immunoglob μ lins from eggs laid by hens immunized with an en 2terotoxigenic E.coli strain [J ]. J Immunol Methods , 1993 , 160(2) : 207- 214.

[2] Terzolo H R. Agglutination of hen egg - yolk immunoglob μ lins (IgY) a 2gainst Salmonella enterica , serovar enteritidis[J ] . Rev Argent Microbiol ,1998 , 30(2) : 84 - 92.

[3] Hansen P ,Scoble J A. Isolation and purification of immunoglob μ lins fromchicken eggs using thiophilic interaction chromatography. [J ] J ImmunolMethods , 1998 , 1; 215(1 - 2) : 1 - 7.

[4] Sugita Konishi Y,Shibata K,Yun S S. Immune functions of immunoglob μ linYisolated from egg yolk of hens immunized with various infectious bacteria[J ]. Biosci Biotechnol Biochem, 1996 , 60(5) : 886 - 888.

[5] Akita EM, Nakai S. Neutralization of enterotoxigenic escherichia coli heat 2labile toxin by chicken egg yolk immunoglob μ linYand its antigen 2 bindfrag 2ments[J ]. Food Agric Immunol , 1998 ,10(2) : 161 - 172.

[6] Li X. Effects of egg and yolk weights on yolk antibody (IgY) production inlaying chickens[J ]. Poult Sci ,1998 ,77(2) : 266 - 270.

[7] Casadevall A. Antibody immunity and invasive fungal infection[J ]. InfectImmun ,1995 , 63(11) : 4 211 - 4 218.

[8] 常 　山 , 张雅萍 . 鸡卵黄免疫球蛋白抗体 (IgY) 研究进展 [J ]. 第三军医大学学报 ,2000 ,22(6) :19 - 22.

( 编辑 　陈聪连 ）