胡国柱　聂荣庆 　张进　文珠　唐宁

【摘要】　目的:使用牙龈卟啉单胞菌(P.g)诱导产蛋母鸡特异性 IgY抗体产生及制备, 特异性 IgY抗体抑制 P.g及其它牙周病病因菌生长。 方法:采用免疫接种、水稀释、盐析、液体培养抑菌及 ELISA等方法, 诱导、提纯 IgY抗体, 抑制 P.g及其它牙周病病因菌生长。 结果:诱导产生的 IgY抗体经硫酸铵盐析提取纯度达 87.6% ～ 89.1%, IgY特异性结合牙龈卟啉单胞菌抗原的结合效价 1∶1 600。 制备的抗牙龈卟啉单胞菌 IgY抗体与牙龈二氧化碳噬纤维菌、中间普氏菌、伴放线放线杆菌、具核梭杆菌等牙周病致病菌的交叉免疫反应抗原结合效价分别为 1∶800、1∶800、1∶6 400、1∶12 800。 抗牙龈卟啉单胞菌 IgY在 5.0、1.0、0.1 g/L时, 分别与牙龈卟啉单胞菌、牙龈二氧化碳噬纤维菌、伴放线放线杆菌、中间普氏菌、具核梭杆菌、粘性放线菌、变形链球菌等厌氧菌在(1×10 8 )CFU/L和(5×10 8 )CFU/L时培养 24 h和 72 h均有不同程度的抑制其生长作用。 结论:牙龈卟啉单胞菌免疫产蛋母鸡诱导产生的特异性 IgY抗体在一定的浓度内有抑制牙龈卟啉单胞菌生长, 以及抑制多种牙周病致病菌生长的作用。牙龈卟啉单胞菌与这些牙周病病因均存在着共同抗原, 其可能具有防治牙周病的前景。

【关键词 】　牙龈卟啉单胞菌 ;牙龈二氧化碳噬纤维菌;中间普氏菌 ;伴放线放线杆菌 ;具核梭杆菌;粘性放线菌 ;变型链球菌 ;IgY;细菌抑制

PreparationofIgYagainstPorphyromonasgingivalisandgrowthsuppressionofthesuspectedpathogensofperiodontaldiseasebyIgYagainstPorphyromonasgingivalis

HUGuozhu1, NIERongqing2, ZHANGJin2, WENZhu3 , TANGNing 4 .1.330006 Nanchang, InstituteofClinicalMedicicalSciences, JiangxiProvincePeople'sHospital,China;2.JiangxiAcademyofTraditionalMedicineandPharmacology, Nanchang;3.JiangxiInstituteofMedicalScience, Nanchang;4.ShenzhenXiliPeople' sHospital

【Abstract】Objective:ApplyingPorphyromonasgingivalisimmunizinghentoinducespecificIgYproduction, andtoobservetheIgYef-ficacyvalueagainstPorphyromonasgingivalis.Methods:Usingimmunization, water-dilution, ammoniumsulfateprecipitation, ELISA,andinhibitingbacteriagrowthtestinliquidanaerobicculture, theIgYwereinduced, extracted, purified, andtheIgYefficacyvaluea-gainstPorphyromonasgingivaliswasobserved.Results:TheIgYpurityreachedto87.6% -89.1% aftersaturationammoniumsulfateprecipitation.TheIgYefficacyvalueagainstPorphyromonasgingivaliswas1∶1600/mgprotein.TheIgYefficacyvalueagainstCapnocy-tophagagingivalis, Prevotellaintermedia,ActinobacillusactinomycetemcomitansandFusobacteriumnucleatumwere1∶800, 1∶800, 1∶6400, 1∶12 800 /mgproteinincross-reactivity, respectively.WhentheIgYconcentrationsofanti-Porphyromonasgingivaliswere5.0,1.0, 0.1 mg/ml, theIgYwasculturedseparatelywithPorphyromonasgingivalis, Capnocytophagagingivalis, Actinobacillusactinomyce-temcomitans, Prevotellaintermedia, Fusobacteriumnucleatum, ActinomycesviscosusandStreptococcusmutansinthe1×10 8 CFU/Land5×10 8 CFU/Lfor24hand72 h.Thegrowthofthesesuspectedpathogensofperiodontaldiseasewasinhibitedinvariousdegrees.Conclusion:ThehenisabletobeinducedtoproducetheIgYofanti-PorphyromonasgingivalisbyPorphyromonasgingivalis.ThespecificIgYofanti-PorphyromonasgingivalisiscapableofinhibitingthegrowthofPorphyromonasgingivalisandtheothersuspectedpathogensof \periodontaldiseases.TherearecommonantigensbetweenPorphyromonasgingivalisandtheothersuspectedpathogensofperiodontaldis-eases, andtherearecrossimmunizingreactivitybetweenthem.Itmayhavetheprospectofperiodontaldiseasepreventionandtreatment.

【Keywords】　Porphyromonasgingivalis;Capnocytophagagingivalis;Prevotellaintermedia;Actinobacillusactino-mycetemcomitans;Fusobacteriumnucleatum;Actinomycesviscosus;Streptococcusmutans;Immuno-globulinY;Bacteriasuppression

         牙龈卟啉单胞菌 (Porphyromonasgingivalis, P.g) 是慢性龈缘炎、慢性牙周炎 、侵袭性牙周炎等牙周病的主要可疑致病菌 ,其菌毛能够与口腔上皮细胞表面的甘油醛 -3 -磷酸脱氢酶结合[ 1], 侵入牙龈上皮细

胞[ 2]和牙龈成纤维细胞[ 3],逃避免疫清除。牙龈卟啉单胞菌产生二肽酰氨肽酶降解结缔组织, 促进 MMP-2· 337 · 实用口腔医学杂志(JPractStomatol)2010 May, 26(3)

和 MMP-1活性增加[ 4]。牙龈卟啉单胞菌的精氨酸和赖氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶 (RgpA、RgpB、Kgp)能水解 IL-12导致 IFNγ产生减少[ 5-6]。部分牙龈卟啉单胞菌菌毛能够诱导巨噬细胞表达 IL-1α、IL-1β、IL-6、TNFα导致牙槽骨破坏[ 7]。本文研制特异性抗牙龈卟啉单胞菌 IgY(YolkImmunoglobulins)抗体 , 并观察其抑制牙龈卟啉单胞菌及其它牙周病致病菌生长, 目的是为牙周病的生物防治提供理论依据。

1　材料与方法

1.1　材料

       牙龈卟啉单胞菌 (P.g)ATCC33277;牙龈二氧化碳噬纤维菌 (C.g)ATCC33624;中间普氏菌 (P.i)ATCC25261;伴放线放线杆菌 (A.a)ATCC29523;具核梭杆菌(F.n)ATCC10953;粘性放线菌 (A.v)ATCC15987;变形链球菌 (S.m, MT6R, C型 )(以上菌种均购于四川大学华西医学院口腔医学研究所)。福氏完全佐剂 (批号 014 K8927, SIGMA-ALDRICH, INC., 美国 )和福氏不 完全佐剂 (批号 112 K8930, SIGMA-ALDRICH, INC., 美国 )。海兰褐母鸡 (南昌莲塘种鸡厂 ,中国), BHI液体培养基 (Difco公司 , 美国 ), 硫酸铵 (AR,批号 040602, 上海试四赫维化工有限公司 )。厌氧培养箱 (DY-2型 ,浙江义乌冷冻机总厂),酶标仪(WellscanMK3,芬兰)。

1.2　方法

1.2.1　免疫接种　按常规方法免疫。将牙龈卟啉单胞菌与福氏完全佐剂或福氏不完全佐剂制备成油包水免疫原 ,皮下免疫海兰褐产蛋母鸡每 2周 1次,共 3次。

1.2.2　抗牙龈卟啉单胞菌 IgY的制备 　按文献 [ 8]方法进行。

1.2.3　IgY纯化 　使用 55%和 33%饱和硫酸铵两步盐析沉淀纯化 IgY。

1.2.4　IgY效价测定　采用间接 ELISA法, 按常规操作进行 。

1.2.5　IgY溶液蛋白含量测定 　应用 Lowry法, 按常规操作进行 。

1.2.6　IgY蛋白纯度测定 　应用非还原性 SDS-PAGE,按常规操作进行 。

1.2.7　抑菌试验 　牙龈卟啉单胞菌及其它牙周病致病菌厌氧培养 48 h, 经鉴定后将数个典型菌落混悬于BHI培养基 ,调整菌液浓度为 (2 ×108)CFU/L～ (1 ×109)CFU/L。用无菌的 BHI培养基对 IgY进行稀释,调整抗牙龈卟啉单胞菌 IgY浓度为 10.0、 2.0、 0.2、0.0 g/L。取牙龈卟啉单胞菌或其它牙周病致病菌菌液 100 μl置于 96孔培养板中, 再加各浓度组 IgY100μl,每组 3孔 。空白对照孔不加菌液只加 BHI培养基 。将 96孔培养板于 37 ℃、厌氧培养 24 h和 72 h。

1.2.8　A值的测定　取厌氧培养 24、72 h的 96孔培养板,用酶标仪测 A 490 , 读取吸光度值 (A)。

1.3　统计方法

     统计学处理使用 t检验 。

2　结　果

2.1　抗牙龈卟啉单胞菌 IgY提取

     应用水稀释法提取的不同批次的抗牙龈卟啉单胞菌 IgY的纯度达到 31.4% ～ 34.6%,结合牙龈卟啉单胞菌的效价达 1∶400。

2.2　抗牙龈卟啉单胞菌 IgY的纯化

不同批次的 55%饱和硫酸铵沉淀的 IgY纯度达到 58.3% ～ 61.2%, 33%饱和硫酸铵进一步沉淀的IgY纯度达到 87.6% ～ 89.1%;33%饱和硫酸铵纯化的 IgY结合牙龈卟啉菌的效价为 1∶1 600。

2.3　纯化的抗牙龈卟啉单胞菌 IgY的结合效价

2.4　纯化的抗牙龈卟啉单胞菌 IgY对牙龈卟啉单胞菌抑制作用

     当抗牙龈卟啉单胞菌 IgY终浓度在 5.0、1.0、0.1g/L时, 牙龈卟啉菌细菌浓度在(5 ×108)CFU/L和 (1×108)CFU/L,经 24 h和 72 h的厌氧培养 ,其抑制牙龈卟啉单胞菌生长率见表 2。

2.5　纯化的抗牙龈卟啉单胞菌 IgY对其它牙周病致病菌抑制作用

     以终浓度为 5.0、1.0、 0.1 g/L的纯化的抗牙龈卟啉单胞菌 IgY分别与 (5 ×105)CFU/L浓度的牙龈二氧化碳噬纤维菌、伴放线放线杆菌、具核梭杆菌、中间普氏菌、粘性放线菌或变形链球菌等进行 24 h和 72 h的厌 氧培养,其抑制细菌生长率见表 3 ～4。

3　讨　论

       牙龈卟啉单胞菌不但引起慢性龈缘炎 、慢性牙周炎 、侵袭性牙周炎等牙周病 ,而且与动脉粥样硬化存在着相关性[ 9-10],目前无选择性针对牙周病致病菌的预防和治疗牙周病的药物, 故本研究期望通过特异性被动免疫方法预防和治疗牙周病。研究表明牙龈卟啉单胞菌不仅能够诱导产蛋母鸡产生特异性 IgY抗体, 而且其效价在免疫后第 4周达到高峰并维持 5个月, 此后效价下降,到第 8个月下降 80%。据此我们认为在第 5个月需要加强免疫 1次。
       本文结果证明特异性抗牙龈卟啉单胞菌 IgY与牙龈二氧化碳噬纤维菌、具核梭杆菌 、中间普氏菌、伴放线放线杆菌有不同程度的免疫交叉反应 (表 1), 从这个实验推断,可能诱导相同疾病的不同种属的细菌之间存在许多相同的表面结构和功能, 以及相同的或近似的抗原决定簇 ,因此存在着交叉免疫反应。事实上Vasel等[ 11] 用牙龈卟啉单胞菌免疫猴子产生的抗牙龈卟啉单胞菌抗体也能与福塞类杆菌 (B.forsythus)产生交叉免疫反应 。牙龈卟啉单胞菌的菌毛素 (fimbrillin,FimA)的活性区域(activedomains)的结构在共生的格氏链球菌 (Streptococcusgordonii)上有表达 , 因此口服S.gordonii诱导产生的特异性血清 IgG和唾液 IgA可以阻止牙龈卟啉单胞菌所致的牙槽骨破坏[ 12]。我们也证明抗伴放线放线杆菌 IgY抗体不但抑制伴放线放线杆菌生长,同时也具有抑制牙龈二氧化碳噬纤维菌生长的作用,证明伴放线放线杆菌与牙龈二氧化碳噬纤维菌存在着共同抗原 13]。

       然而我们的研究也发现牙龈卟啉单胞菌诱导母鸡产生的特异性 IgY效价明显低于牙龈二氧化碳噬纤维菌、具核梭杆菌 、中间普氏菌、伴放线放线杆菌等诱导母鸡产生的特异性 IgY的效价 (资料未显示 ), 我们认为这可能与牙龈卟啉单胞菌上独有的抗原决定簇弱或其表面可能存在着免疫抑制分子相关 。本文结果表现出牙龈卟啉单胞菌表面存在的与其它牙周病致病菌共有的抗原决定簇很强, 这也许证明生物学效应相同的不同种属的细菌具有相同的抗原结构, 如本文所见特· 339 · 实用口腔医学杂志(JPractStomatol)2010 May, 26(3)异性抗牙龈卟啉单胞菌 IgY与伴放线放线杆菌和具核梭杆菌的抗原结合效价更高, 分别为 1∶6 400和 1∶12 800。由于本文应用的 IgY是多克隆的, 因此能够很好地表现出这一特点,我们推测这种现象具有一定的普遍性 ,这更具有抗菌广谱性特点,有利于临床应用。

       抗牙龈卟啉单胞菌 IgY与牙龈卟啉单胞菌共同培养不但能抑制牙龈卟啉单胞菌生长的作用 (表 2),而且也能较好地抑制牙龈二氧化碳噬纤维菌 、具核梭杆菌 、中间普氏菌、伴放线放线杆菌 、粘性放线菌 、变型链球菌等牙周病致病菌的生长 (表 3 ～ 4)。这个结果表明多克隆 IgY抗体有结合细菌的效价而具有抑制细菌生长功效。 有学 者证明在 皮室模 型 (subcutaneouschambermodel)中给于抗牙龈卟啉单胞菌 IgG促进牙龈卟啉单胞菌的清除 ,防止牙槽骨破坏[ 14]。抗牙龈卟啉单胞菌 Mr40 000膜蛋白的 IgG抗体在补体的调理下促进粒细胞吞噬和杀死牙龈卟啉单胞菌[ 15]。本文还发现特异性抗牙龈卟啉单胞菌 IgY抑菌率并不完全与细菌结合效价成正比, 如抗具核梭杆菌和伴放线放线杆菌的效价是抗牙龈卟啉单胞菌的 4～ 8倍(表 1),但其抑菌率却没有差异。可能的原因有:①多克隆 IgY抗体中虽然都能与细菌结合, 但是多种抗不同抗原决定簇的抗体中有抗抑制细菌生长有关受体的抗体 (抑制性抗体), 其抑制细菌生长 ;也有抗刺激细菌生长有关受体的抗体 (刺激性抗体 ), 其刺激细菌生长;同时也有抗与生长、抑制无关的受体分子的抗体 ,其对细菌生长无影响 。 ②抗牙龈卟啉单胞菌 IgY与其它牙周病致病菌交叉反应的共同抗原受体可能主要是那些与生长 、抑制无关的受体分子,仅有少部分交叉反应的共同抗原受体与生长有关 ,或同时存在着一些刺激性生长受体抗原,故表现出 IgY对细菌结合力与其对细菌抑

制率不成比例的现象 。
       总之,本研究提示, 口腔含漱抗牙龈卟啉单胞菌IgY可能会有助于牙周病的预防和治疗, 长时间使用甚至有可能达到治愈的目标。

参 考 文 献

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(收稿:2009-07-04　修回:2009-10-13)