蒙永祥　张　玲①　黄春龙　林学颜②　(广东省大日生物化学药业有限公司,广州 510507)

　　中国图书分类号　R730　　文献标识码　A　　文章编号　1000-484X(2004)06-0393-03

　　[ 摘　要] 　目的:应用咽喉分离的细菌混合抗原免疫母鸡, 提取鸡蛋黄中 IgY, 通过 ELISA 方法证实 IgY 抗体的特异活性。方法:采取咽喉炎相关的多种细菌作抗原免疫产蛋母鸡 , 收集鸡蛋, 从蛋黄中提取 IgY, 经纯化后进行 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和抗体活性的 ELIAS 测定。 结果:电泳呈现12 条带, 证明IgY 抗体中至少有 12种抗体成分 , ELISA 结果表明 IgY 抗体效价为1∶512。 热稳定性试验结果显示, 在 37℃温度下, IgY 抗体活性无改变。 结论:应用多种混合的细菌抗原免疫母鸡, 其鸡蛋黄中含有相应的 IgY 抗体成分, 对热具有高度稳定性。

　　[ 关键词] 　鸡蛋黄;免疫球蛋白 IgY;细菌复合抗原;抗体

Study on the activity of IgY against complex bacteria in pharynx and throat

MENGYong-Xiang ,ZHANG Ling , HUANG Chun-Long ,LIN Xue-Yan .Great Sun Company of Biochemistry Pharmacolo-gy ,Guangzhou 515007, China

     [ Abstract] 　Objective:To detect the activity of IgY against complex bacteria in pharynx and throat.Methods:Purified antigens against bacteria in pharynx and throat was used to immunize egglaid hens.The eggs from immunized hens were collected and abstract IgY from the yolks.The antibody activity of IgY was detected by SDS-PAGE electrophoresis and ELISA.Results:SDS-PAGE electrophoresis represented at least twelve ladders, and the titer of ELISA was 1∶512.Conclusion:IgY antibody was obtained in egg yolk after immunized henswith complex bacteria.The activity of IgY was detected.IgY showed stable to heat.

      [ Key words] 　Egg yolk;Immunoglobulin yolk IgY;Bacteria complex antigen;Antibody

　　采用鸡作为免疫宿主产生大量有效的免疫球蛋白 IgY 是收集抗体的好方法。Klemperer 在 1893 年已指出母鸡的抗体是从血清传递至蛋黄中, 授予鸡胚胎或雏鸡的被动免疫性。1981 年 Jensenius 等 , 通过实验证实鸟类就像哺乳类动物一样, 用抗原免疫的母鸡产生抗体的免疫性可以通过血清转递至蛋黄中,以保护其子代。由于在鸡体内只有 IgG 分子能通过卵黄囊转输至蛋黄中, 因此用抗原免疫的母鸡所生的鸡蛋黄中只有 IgG 分子, 因鸡蛋黄的英文名称为“Yolk”, 特取它的第一个字母“Y”为代表, 将鸡蛋黄中的免疫球蛋白 IgG 称之为 IgY(ImmunoglobulinYolk,IgY)。IgY的优点是由于它的种系发生距离较远[ 1],IgY 抗体可以识别一些哺乳类动物相同类型的蛋白质 ,使它得到更广泛的应用 ,以常规的免疫学方法获得 IgG 抗体和 IgY 抗体相比较 ,免疫一只兔每月可获得 200 mg IgG(特异性抗体约 5%), 鸡的IgY抗体每月可收获 1 500 mg(特异性 IgY 为 2%～10%)[ 2]。Fis-cher 等人的研究也指出 IgY 抗体具有无需放血, 仅收集免疫的鸡蛋, 即可从蛋黄中获得①中山大学肿瘤防治中心实验研究部, 广州 510089②中山大学中山医学院免疫学教研室, 广州 510089

作者简介:蒙永祥(1959 年-), 男, 副主任医师, 主要从事新药研制开发。大量而效价持久的 IgY 抗体, 方便而经济, IgY 的分离快速而简单等特性[ 3]。
　　本文应用引起咽喉炎和扁桃体炎的病原菌免疫产蛋的母鸡 ,提取鸡蛋黄中 IgY抗体,并采用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳检测其抗体成分,ELISA 测定其活性[ 4],并进行 IgY热稳定性试验 。结果证实鸡蛋黄中 IgY 抗体的特异性活性, 为免疫球蛋白 IgY在临床诊断与治疗的应用提供了有力的依据 。

1材料与方法

1.1　动物　来亨鸡购于华南农业大学 。

1.2　抗原　多种细菌复合抗原由广东省大日生物化学药业有限公司和美国雅臣药业集团有限公司提供 ,其中含金黄色葡萄球菌 、白色葡萄球菌、β-溶血性链球菌 、G 簇溶血性链球菌、肺炎球菌、类白喉杆菌 、乳杆菌 、大肠埃希氏菌、拟杆菌等研制“喉友”咽喉喷剂的细菌复合抗原 ,冻干保存备用。

1.3　免疫 　新产蛋母鸡两只, 每只分别于双翅皮下 、背部两侧皮下、腹部和双腿部皮下注射, 每周 1次 ,每次注射抗原 1 ml(加完全福氏佐剂),共 4 次,最后一次注射后 3 天,加强免疫一次,一周后开始收

集鸡蛋 ,置 4℃冰箱保存备用。· 393 · 蒙永祥等　抗咽喉细菌复合抗原的 IgY 抗体活性研究　第 6 期

1.4　IgY抗体的纯化 　鸡蛋外壳经消毒后, 剪一小孔,吸除蛋白,分离提取蛋黄液 ,加 9 倍体积 pH7.0,0.1 mol L 磷酸缓冲液(含 0.06 mol L NaCl), 置电动搅拌器搅匀 ,应用 10 mg ml 蛋黄液, 上 DEAE-Sepha-dex A50柱(2.5×3.5 cm)滤过 ,分部收集(20 ml h),5.0 ml 分部 。取每峰洗脱液, 以 ELISA 方法测定抗体活性,用 0.22 μm 滤膜除菌并冻干 。

1.5　ELISA 试验 　按常规方法进行。羊抗鸡 IgG-HPR(生产厂家 KPL , Size :0.05 mg , 使用浓度范围 :1∶500～ 1∶2 500)。
1.5.1　包被抗原:酶标反应板在包被前用缓冲液洗涤3 次,甩干, 每排 1～ 10 孔加抗原 0.1 ml 包被 , 12 孔加包被液 0.1 ml ,置 4℃过夜 。
1.5.2　次日倾去所有液体 , 以洗涤液洗 4 次 , 每孔加5%小牛血清稀释液 0.1 ml , 置 37℃培养箱封闭40 分钟(或置 4℃过夜),洗 4 次 。
1.5.3　加样:取上述纯化的待测 IgY抗体, 用 5%小牛血清稀释液按 1∶2 、1∶4、1∶8 等倍比稀释至1∶1 024, 第 1～ 10孔分别加等比稀释液 0.1 ml ,每个稀释度设 3 个复孔,第 12 孔加 5%小牛血清 0.1 ml ,置37℃培养箱孵育 40分钟后 ,取出洗 4次 。
1.5.4　每孔加入羊抗鸡 IgG-HRP 抗体 0.1 ml , 置37℃培养箱 40 分钟,然后洗 4 次。
1.5.5　显色:每孔加入酶免底物一滴, 显色后再加一滴终止液,终止显色反应。

1.6　SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 　取 SDS-聚丙烯酰胺凝胶 1 支, 溶于 200 ml 双蒸水 , 分装小管 ,10μl 管 ,取一管加 Tris-HCl 缓冲液 10 μl ,室温融化后 ,在沸水浴中加热 5 分钟后上样。电泳时间为 50 分钟,干胶后 ,用考马斯兰 R-250染色, 观察结果。

1.7　IgY热稳定性试验　将纯化的 IgY抗体原液,分别置37℃、45℃、55℃、65℃、75℃, 15 分钟后, 以上述缓冲液稀释500 倍, 进行 ELISA 试验 。

2　结果

2.1　SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果 　纯化的鸡蛋黄 IgY 经 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后用考马斯兰R-250染色, 显示 12 条带(见图 1)。

2.2　ELISA 测定结果 　按上述操作后, 酶标板置酶标仪 450 nm 波长,检测 OD 值 ,以 P N 值 ≥2.1 为阳性 ,结果如表 1。由表 1可以看出,根据P N 值 ≥2.1为阳性 , 当倍比稀释度到 1∶512 时仍为阳性 , 表明“喉友”口腔喷剂中 IgY 浓度达到该水平即可检出,即其效价为 1∶512。

2.3　IgY 热稳定性 　37 ℃15 分钟 , IgY 抗体的活性几乎无变化, 在 45℃、55℃、65℃15 分钟, IgY 抗体活性下降约30%,在 75℃其活性迅速下降 。

Fig.1　Result of SDS-PAGE electrophoresis for IgYNote:1, 2.purifyied IgY;M .marker.

3　讨论

       据考证 IgY 的进化已有 300 亿年的历史 , 从它的进化过程表明 IgY 的功能可能是从 IgG 进化的 ,而且是较高级的抗体 。IgY 存在于多种动物中 , 由较低等的动物、两栖类脊椎动物, 以至高级的鸟类 ,在这些不同种属的动物中 ,IgY 是血液中的 IgG 透过卵黄囊转递至蛋黄中的免疫球蛋白 ,近年来已经由许多免疫学家研究证实, 蛋黄中的 IgY 十分浓集, 滴度比血液 IgG 至少高一个滴度。我们实验室测定结果也表明蛋黄 IgY 浓度比血液 IgG 高一个滴度 。由于IgY 的种系发生与哺乳动物 IgG 抗体的相距较远。因此, 采用抗原免疫产蛋母鸡从鸡蛋黄中可以收集到大量纯度高的 IgY, 可作为医学上的诊断试剂和治疗制剂[ 5,6],其优点之多是免疫哺乳类动物不可替代的 ,用抗原免疫母鸡收集鸡蛋方便,无需放血和宰杀动物并可大量连续地收集鸡蛋提取 IgY, 源源不断地为诊断试剂和治疗制剂提供原料。

       本实验应用咽喉炎、扁桃体炎患者炎症局部常见细菌和正常人咽喉部分离的细菌 , 如A 簇 β 型溶血性链球菌、肺炎双球菌 、溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌等细菌混合免疫来亨鸡 ,再从免疫母鸡的鸡蛋黄中提取获得 IgY 抗体, 经 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后所呈现的 12 条带 ,说明了本实验应用细菌免疫母鸡能够得到相应的 IgY 抗体 , 在ELISA 实验中也得到了证实;本实验对 IgY 抗体的稳定性也进行了研究 ,结果表明 IgY抗体在 37℃条件下稳定性好 , 适于大量制备和保存 。多年来人们一直沿用传统的免疫学方法 ,利用抗原免疫哺乳动物 ,例如鼠 、兔 、羊或马等, 再抽取血液分离血清 ,从中提取免疫球蛋白抗体 , 用于研制各种生物药物和诊断试剂 ,为人类疾病的诊断治疗和预防作出了巨大的贡献 。随着科学的飞速发展, 从免疫母鸡所生的鸡蛋黄中提取 IgY 抗体制备生物诊断试剂和治疗制剂是一项崭新的技术 , 它有可能逐渐替代应用免疫动物提取血清免疫球蛋白的传统方法。

4　参考文献

1　Gassmann M, ThommesP , Weiser T et al .Efficient production of chickenegg yolk antibodies against a conserved mammalian protein[ J] .FASEB J,1990;4:2528-2532.

2　Schade R, Burger W, Schoneberg T et al .Avian egg yolk antibodies, theegg-laying capacity of hens following immunization with antigens of differ-ent kind and origin and the efficiency of egg yolk antibodies incomparisonto mammalian antibodies[ J] .Altex Alternativen ZU Tierexp, 1994;11:75-84.

3　Fischer M, Hinak A ,Montag T et al .Comparison of standard methods forthe preparation of egg yolk antibodies[ J] .Tierarztliche Praxis, 1996;24:411-418.

4　Larsson A.Determination of circulating immune complexes by chicken an-ti-human C3 and anti-human C1q micro ELISA[ J] .J Immunol Methods,1998;113(1):93.

5　Gardner P S, Kaye S.Egg globulin in rapid virus diagnosis[ J] .J VirolMethod, 1982;4(1):257.

6　Carlander D ,Kollberg H, WajakerP E et al .Peroral immunotherapy withyolk antibodies for the prevention and treatment of enteric infection[ J] .Immunol Res,2000;21:1-6.

[ 收稿 2003-04-02　修回 2003-05-19]

(编辑　许四平)