袁　 铿1, 汪　 泱2, 詹天佐3

(1.江西省医学科学研究所肿瘤研究室, 江西 南昌 330006;
2.江西医学院第一附属医院泌尿外科研究所 ,江西 南昌 330006;
3.广东省珠海市香州医院口腔科, 广东 珠海 519000)

摘要:目的:制备具有高效免疫活性的抗致龋菌鸡卵黄免疫球蛋白(IgY), 评估其临床防龋功能。 方法:以变形链球菌皮下注射免疫产蛋母鸡, 采用聚乙二醇(PEG)两步沉淀法提取 IgY, 微量凝集试验检测 IgY 免疫效价及交叉免疫

特性, 并观察其抑菌效果, 与含氟漱口水比较其临床防龋功能。 结果:作者制备的 IgY 免疫效价为 1∶512, 具有抑制变形链球菌生长, 并与其他较常见的变形链球菌 c、e、f 血清型结合发生交叉凝集反应, 经临床验证结果表明 IgY 漱口水与含氟漱口水龋患发生率相近。 结论:抗变形链球菌鸡卵黄免疫球蛋白制剂具有防龋功能。

关键词:变形链球菌;IgY抗体;龋齿 预防和控制

中图分类号:R781.1;R378.1 + 1

文献标识码:A

文章编号:1000-2294(2002)06-0153-03

Preparation and Clinical Effect of IgY of Anti-Cariogenic Bacterial

YUAN Keng1, WANG Yang2, ZHAN Tian-zuo3

(1.Department of Tumour , jiangxi Provincial Research Institute of Medical Sciences,

Nanchang 330006, China ;2.Department of Urology , the First Affiliated

Hospital ,Jiangxi Medical College , Nanchang 330006, China ;

3.Department of Stomatology , Xiangzhou Hospital of Zhuhai ,Zhuhai 519000 ,China)

Abstract:Objective :To Prepare IgY extracted from chicken-egg-yolk and to evaluate its anticarious effect .Methods:Egg-laying henswere immunized with hypodermal injection of streptococcus mutans.IgY was puri-

fied with PEG two-step precipitation .The titer and specific property of cross-immunization of IgYwere detectedby microagglutination tests.Its bacteriostatic effect was observed and its clinical anticariogenic function was

compared with that of fluorine-containing gargle .Results:The titer of IgY prepared in the laboratory was 1∶512 with properties of inhibiting growth of streptococcus mutans and having cross-agglutinative reaction with other common S .mutans c, e ,f serum groups.Clinical verification proved approximate incidence of dental caries in population using IgY gargle and in those using gargle containing fluorine .Conclusion:Preparation of anti-S .mu-

tans chicken-egg-yold immunoglobulin has protection against dental caries.Key words:streptococcus mutans;IgY antibody;dental caries prevention and control

       龋病是人群中普遍存在的感染性疾病, 严重损害医学人体美, 尤其是容貌美 ;变形链球菌与龋病的关系十分密切 , 为了寻找有效的防龋手段[ 1]上世纪60年代起国外学者便开始了免疫防龋研究 。近年来,由于被动免疫较主动免疫安全性高 , 可行性好 ,被广大学者所重视[ 2]。

       从鸡卵中获得的抗体 IgY 具有不同于 IgG 的生物特征,如 IgY对哺乳动物的补体成分无固定作用 ,也不与 FC 段结合 , 它对人类的病原体及哺乳动物的高度保守的蛋白质具有较强的免疫应答反应 ,而且对热 、酸均具有很强的耐受性, 稳定性好, 制备简单,来源方便[ 3]。因此, 作者制备了抗致龋菌IgY,并对其体外免疫学功能及体内防龋功能进行研究。

1　 材料与方法

1.1 　实验动物

      美国来亨鸡(本院动物科学部提供)39 只, 常规饲养 。

1.2 　抗原制备

      变形链球菌 Inbritt(c)、LM 7 (e)、OMZ-175(f)、BHR(d)菌种由北京市口腔医学研究所提供 。用自配含蔗糖的TS 培养基于厌氧环境中复苏,培养变形链球菌 48 h , 增菌培养 48 h, 收集变形链球菌, 用PBS 洗涤后调节菌浓度至 2×109 CFU ml , 超声波粉碎,4℃保存备用 。

1.3 　免疫

      150 d龄健康开产母鸡, 隔离喂养一周 。以 2×109 CFU ml 变形链球菌与等量福氏完全佐剂对母鸡进行皮下多点注射,3 周后进行再次免疫 ,首次免疫两周后试血开始收集鸡蛋 。从免疫前一周起每周连续观察鸡血清抗体效价, 当抗体效价趋于下降时, 加强免疫一次。

1.4 　抗变形链球菌 IgY 的提取

      采用聚乙二醇二步沉淀法。取卵黄, 加入二倍量的 PBS 和 3.5%(W V)聚乙二醇 MW6 000 混匀后,离心, 9 000rpm, 15 min。取上清加入同上 PEG ,使其成12%浓度(W V),离心 9 000rpm ,15 min,将沉淀溶于 PBS 中 , 即为变形链球菌 IgY 粗制品 。用同样方法提取未免疫鸡卵黄 IgY 作对照 。Lowry 法测定蛋白含量。

1.5 　微量凝集试验检测 IgY 免疫效价

      收集培养 48 h 变形链球菌 ,用生理盐水洗涤后计数, 调细菌浓度至 5×106 ml , 加入 U 型微量板中 ,每孔 50 μl ,抗变形链球菌 IgY(蛋白含量调至 2 mgml)作倍比稀释,每孔50 μl ,混匀 ,置37℃孵育 2 h后置4℃24 h 后观察凝集果。同时设未免疫鸡卵黄IgY 作对照。以能发生凝集反应的最大稀释倍数为凝集效价 。

1.6　抗变形链球菌 IgY 与其他血清型变形链球菌

     交叉凝集反应

     将变形链球菌 Inbritt(c)、OMZ-175(f)、LM 7 (e)、BHR(d)分别与抗变形链球菌 IgY 进行凝集试验, 方法同上。

1.7　IgY 抑菌试验

     实验组:将5×106 ml 变形链球菌与抗变形链球菌 IgY(蛋白含量为 2 mg ml)混合 , 增菌培养 48 h后, 用平板倾注法对细菌进行计数 ,观察细菌生长情况。对照组:以PBS 代替 IgY。每样本设 3 个复管。

1.8　临床观察实验

     将 IgY 漱口水(抗体效价为 1∶64)与 0.2%NaF漱口水进行对比试验 ,比较两种含漱液对龋齿发生率的影响 。随机选 200名 4～ 6 岁儿童 ,分成 IgY 漱口水组:99 人和 NaF 漱口水组:93 人, 试前作基线调查, 统计龋均 。含嗽方法 :先偏左 ,后偏右, 最后居中含漱 1 min ,每周 1 次, 连续 3 个月 ,统计龋均 。

1.9　统计学处理

     采用 χ2检验 。

2　 结果

      抗变形链球菌 IgY 抑菌实验室结果显示, 实验组菌落形成单位为(5±1.4)×109 CFU ml , 对照组菌落形成单位为(1.5±0.6)×1012 CFU ml ,实验组细菌生长明显少于对照组(P <0.01)。结果说明抗变形链球菌 IgY 具有抑制变形链球菌生长的作用。

      临床试验结果显示, IgY 漱口水组 99 人, 患龋68 人, 患龋率为 68.7%, 较实验前上升 2.4%;NaF漱口水对照组 93 人, 患龋 63 人, 患龋率为 67.7%,较实验前上升3.2%,经 χ2检验 ,两组患龋率无显著性差异(P >0.05), 见表 2。结果初步表明 , 含 IgY漱口水与含氟漱口水预防龋齿发生率相近, 龋齿上升率甚至低于后者。

3　 讨论

      变形链球菌是公认的致龋菌。采用抑制细菌的方法可以有效地预防龋病发生 。本实验以变形链球菌 Inbritt(c)、OMZ-175(f)、LM 7 (e)、BHR(d)为抗原免疫母鸡 ,用聚乙二醇两步沉淀法从鸡卵黄中提取抗变形链球菌 IgY,蛋白含量测定每枚鸡卵可制备 100mg 左右特异性抗体。这种来源充分, 成本低的方法,使得大量提取特异性抗体具有可行性 。许多研究表明,用 IgY特异性抗体进行被动免疫,在肠道细菌感染 、病毒以及寄生虫感染防治方面有显著作用[ 4],近年来国内外一些学者在 IgY 免疫防龋方面也进行了一些探讨, 并取得了一定的进展[ 1～3、5～ 7]。有文献报道的结果表明 IgY 免疫组龋齿记分明显低于对照组 。而 IgY 抗体的免疫效应也在我们上述一系列实验中得到了证实 。

      还有研究表明 ,特异性单克隆抗体能够有效阻止变形链球菌定居于牙齿表面 , 从而预防龋齿发生[ 7]。作者成功地获得特异性抗变形链球菌 IgY 以后, 经过临床验证, 其防龋效果与 NaF 相当。NaF 具有较好的防龋效果已被公认, 但过量摄入对人体有害。而 IgY 来源于鸡蛋,对人体无毒副作用,且来源广泛 ,产量高, 抗原应答反应持续时间长, 便于产业化生产,因此有必要对其有效防龋的最佳浓度及保存方式等作进一步探索 。

参考文献:

[ 1] 　 张平, 樊明文, 边专, 等.单克隆抗体对茸毛链球菌粘附及龋病发生的影响[ J] .中华口腔医学杂志,1999, 34(2):109-111.

[ 2] 　 边专, 樊明文, 杜民权, 等.变形链球菌高表达株免疫牛奶应用研究[ J] .口腔医学纵横, 1999, 15(1):23-24.

[ 3] 　 Lise Svendsen,Annette Crowley ,Ostergaard LH, et al.Development andcomparision of purification strategies for chicken antibodies from Eggyolk[ J] .J Laboratory Animal Science, 1995,45(1):89-93.

[ 4] 　 陈翠萍, 杨朝晖, 王永谦.IgY 抗体在体外和体内对幽门螺杆菌作用的研究[ J] .中华微生物学和免疫学杂志, 2002,22(1):37-40.

[ 5] 　 樊明文, 杜民权, 边专, 等.变形链球菌表面蛋白质抗原Ⅰ Ⅱ皮下免疫 BALB C 小鼠的实验研究[ J] .中华口腔医学杂志, 1998,33(3):149-151.

[ 6] 　 江千舟, 樊明文, 李宇红, 等.鸡蛋黄抗体 IgY 的急慢性毒性实验[ J] .牙体牙髓牙周病学杂志, 2001, 11(6):389-391.

[ 7] 　 文立亚, 张传彬, 岳松龄.单克隆抗体对变形链球菌生长的影响

[ J] .口腔医学纵横杂志, 1996, 12(1):13-14.

(责任编辑:胡炜华)