姜大川 综述 徐 燕 审校

（安徽医科大学附属口腔医院口腔内科 安徽 合肥 230032 ）

[摘要] 牙周炎是一种细菌性感染性疾病，而牙龈卟啉单胞菌是牙周炎的主要优势致病菌之一。母鸡在经某种微生物免疫后，能产生针对此微生物的特异性抗体，且此抗体大量转移到蛋黄中。经提纯得到的抗体，被称为蛋黄免疫球蛋白（IgY）。抗牙龈卟啉单胞菌 IgY 在防治牙周炎方面有着良好的前景。下面就 IgY 的性质和特点、IgY 在牙周病治疗中的应用等研究进展作一综述。

[关键词] 牙龈卟啉单胞菌； 蛋黄免疫球蛋白； 抗体； 免疫

[中图分类号] R 780.2 [文献标志码] A [doi] 10.3969/j.issn.1673-5749.2009.06.015

Anti-Porphyromonas gingivalis immunoglobulin yolk immune in prevention and treatment periodontitis

JIANG Da-chuan, XU Yan.（Dept. of Oral Medicine, The Affiliated Hospital of Stomatology, Anhui Medical Univer－sity, Hefei 230032, China）

[Abstract] Periodontitis is a bacterial infectious disease caused by microbial pathogens, and Porphyromonas gingivalis （P.gingivalis） is one of the prominent pathogens. Hen immunized with certain micro-organism can produce specific antibodies against the micro-organism，which can be transferred to the egg yolk in large numbers. The purification of the antibodies is also known as the immunoglobulin yolk（IgY） . Anti-P.gingivalis IgY may provide a promising insight into the prevention and treatment of periodontitis. This review reported the research progress of the nature and characteristic of IgY and the use of IgY in prevention and treatment of periodontitis research.

[Key words] Porphyromonas gingivalis； immunoglobulin yolk； antibody； immunity

       牙龈卟啉单胞菌为革兰阴性厌氧菌，是牙周病，尤其是约占牙周炎患者 95%以上的慢性牙周炎病变区或活动部位的主要优势菌，也是口腔固有菌群之一 [1] 。牙龈卟啉单胞菌含有一系列逃避宿主防御机制和破坏宿主组织的毒性因子 [2] 。近年来，随着分子细菌学和免疫学的发展以及对牙周炎致病菌研究的深入，免疫防治牙周炎已备受关注。但由于龈下菌群的复杂性，故牙周炎免疫防治的研究进展非常缓慢。母鸡经某种微生物免疫后，能产生针对此微生物的特异性抗体且此抗体大量转移到蛋黄中，这种从蛋黄中提取的抗体称为蛋黄免疫球蛋白Y（immunoglobulin yolk，IgY）。由于进化的差异，蛋黄特异性抗体可与抗原上的多个抗原决定簇反应，起到信号放大作用 [3] 且具有多种不可替代的优点；因此，IgY 可作为一种廉价的易获得的抗体，广泛应用于疾病的诊断和防治 [4-5] 。

1 IgY 的性质和特点

1.1 IgY 的一般性质

       鸡蛋黄对抗体有浓集作用，使其不断储存于蛋黄中 [6] 。IgY 的相对分子质量约为 180，所含的2 个亚单位为 65～70 的重链和 22～30 的轻链。IgY的结构与 IgG 相似，但相对于哺乳类的 IgG，IgY的铰链区短、可变性差且 Fc 段长，因而具有两大不可替代的优势。一是生物学优势：IgY 不激活补体，不与 Fc 受体和人类风湿因子结合，与哺乳动物间种系发生距离大，不会发生免疫球蛋白间的交叉血清学反应，从而避免了免疫检测过程中产生的假阴性或假阳性结果 [7] 。二是制备优势：IgY 耐热、耐酸且稳定性好，制备成本低、产出率高且提纯简便快捷，均一性强。

1.2 IgY 的稳定性

       为了使 IgY 在免疫防治中较好地发挥作用，抗牙龈卟啉单胞菌蛋黄免疫球蛋白免疫防治牙周炎在储存、处理或治疗过程中，抗体的稳定性十分重要。IgY 具有耐热、耐酸以及一定的抗酶降解的能力。1）IgY 耐热：将 IgY 制剂于 4 ℃贮存 5年或室温下放置 6 个月，其抗体活性几乎不变 [8] ；将其溶解于生理盐水中且于 4 ℃贮存 6～7年，抗体活性降低不超过 5%；将蔗糖、麦芽糖或甘油加入到稀释的蛋黄抗体溶液中，可有效地阻止IgY抗体在 70 ℃时的变性，但在温度超过75 ℃以后，IgY 抗体则出现变性 [9] 。2）IgY耐酸：当 pH 值大于 3 时，其抗体活性无明显影响，尤其在 pH值为 5～7 时相当稳定；当 pH 值小于 3 时，其抗体活性明显下降 [10] ；即使是在 37 ℃的胃蛋白酶作用下，蛋黄抗体的活性在 90 min 内亦无改变。此外，IgY 还具有耐高渗的性能和较好地耐反复冻融的特性。

1.3 IgY 的安全性

       江千舟等 [11] 将鸡蛋黄抗体冻干粉制备成喷漱液，经口灌胃途径给予昆明小鼠和威斯塔大鼠，观察记录实验动物中毒症状和死亡情况后发现：实验动物情况良好，行为正常，未见明显中毒症状和死亡发生；IgY 对血液学和生化学以及脏器系数（脏器质量/动物身体质量）和组织病理学等指标无明显影响；IgY 无急慢性毒副作用，属于无毒性类物质，是一种安全有效的口腔局部预防制剂。因此，IgY 对寻求一种经济、安全和有效以及易标准化生产的疫苗具有重要意义 [12] 。

1.4 IgY 的高产率和经济性
       少量的抗原刺激就能在免疫母鸡的蛋黄中获得大量而且能持续表达的 IgY 抗体 [13] 。经抗原免疫的母鸡，10 d 左右就可在其蛋黄中产生抗体，30 d 左右抗体量达到高峰，其特异性抗体的效价可持续 2～6 个月。传统收集免疫动物抗体，是通过采血或宰杀动物来完成。但是，IgY 抗体的收集与传统方法完全不同，它是通过收集免疫母鸡的鸡蛋，用各种免疫学以及生物化学方法从其蛋黄中提取纯化抗体的 [14] 。单个鸡蛋黄中的 IgY 的量可超过100 mg [15] 。1 只母鸡在 1 个月中生产制备的蛋黄抗体相当于 500 mL 的动物血清抗体，且母鸡的饲养成本更低。因此，这是一种简单易行、经济安全的获得抗体的非侵入性方法，既减少了实验动物的用量，也减少了对动物的伤害。
2 IgY 在牙周病治疗中的应用

       牙周病是口腔的两大常见病之一，与冠心病、脑卒中、慢性肺部感染、孕妇早产低身体质量儿出生、糖尿病、急性或亚急性感染性心内膜炎、动脉粥样硬化、心瓣膜炎和低血性心脏病等关系密切。目前，有关牙周炎治疗主要包括基础治疗和牙周手术等。常规的机械治疗和手术治疗只能暂时控制菌斑、消除炎症和阻止病变加重。重度牙周炎由于其牙周袋结构的复杂性导致刮治器械进入困难，难以彻底地清除龈下致病菌，因而会造成病情的复发和加重。如果在机械治疗的基础上加以免疫方法辅助，提高局部组织中特异性抗体的滴度，就可能达到减少病原菌，防治牙周炎的效果。

2.1 牙龈卟啉单胞菌的免疫防治

       自 20 世纪 90 年代以来，各国学者都开展了针对牙周炎疫苗的研究。牙周炎是一种感染性疾病，菌斑细菌是其始动因子。牙龈卟啉单胞菌含有一系列逃避宿主防御机制和破坏宿主组织的毒性因子。由于该菌菌体成分复杂，有些因子还有免疫抑制作用，因此牙周炎疫苗的发展趋势是鉴定能够提供免疫保护的抗原成分，如牙龈素、菌毛和血凝素等。牙龈素是牙龈卟啉单胞菌表面的精氨酸-赖氨酸特异性的半胱氨酸蛋白酶，这些蛋白酶分别由 rgpA、rgpB 和 kgp 基因编码。体外试验显示，牙龈素可以降解多种宿主蛋白和蛋白酶抑制剂，水解补体 C 5 ，破坏细胞基质 [16] 。
       Kuboniwa等 [17] 编码 kgp 催化区和 rgpA 催化区的质粒免疫小鼠，所产生的 IgG 抗体可明显地抑制牙龈卟啉单胞菌凝集红细胞的作用，也能明显地抑制精氨酸-赖氨酸特异性的蛋白水解活动。许静等 [18] 利用 PCR 技术和基因重组技术克隆牙龈卟啉单胞菌精氨酸牙龈素催化结构域（rgpAcatalytic domain，rgpAcd）基因，并将其在大肠杆菌中表达 RgpAcd 蛋白。张凤秋等 [19] 成功地构建了分泌型牙龈卟啉单胞菌牙龈蛋白酶 K 基因的真核表达载体 VR1020/KGPcd，并发现其在哺乳动物细胞中可正确地表达和分泌。上述研究，为进一步研制重组载体疫苗奠定了基础。
       菌毛是牙龈卟啉单胞菌菌体表面卷曲的丝状蛋白附属器，在细菌定植和侵入牙周组织的过程着重要的作用，而且其可刺激白细胞介素-1、6、8 以及肿瘤坏死因子和集落刺激因子等致炎性细胞因子的产生，导致骨质吸收和其他炎症反应 [20] 。Sharma等 [21] 用人类共生菌格氏链球菌作载体表达于牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白功能区的 C 端和 N 端，口腔免疫无菌鼠，诱导产生了菌毛蛋白（fimbrilline，Fim）A特异性的血清 IgG 和 IgA 以及唾液 IgA 抗体反应，降低了牙龈卟啉单胞菌引起的牙槽骨丧失。国外学者纯化了相对分子质量为1.3×10 5 的血凝素蛋白 A，并利用其转基因小鼠获得人单克隆抗体。这种抗体对相对分子质量为1.3×10 5 的血凝素有高度特异性和亲和力，能显著地抑制牙龈卟啉单胞菌的血细胞凝集作用和囊泡，因此可能在牙周炎的被动免疫治疗中起作用 [22] 。

2.2 抗牙龈卟啉单胞菌 IgY 的应用

       周萍等 [23] 对 100 例慢性牙周炎患者进行了分组临床实验，实验组使用特异性抗牙周病 IgY 抗体牙周滴注治疗牙周病，对照组进行常规牙周病治疗，分别就患者的牙龈指数、菌斑指数、牙龈出血指数和牙周袋深度进行比较，结果发现特异性抗牙周病 IgY 对慢性牙周炎具有良好的临床疗效。Yokoyama等 [24] 发现，抗牙龈卟啉单胞菌重组外膜蛋白 IgY 可特异性地识别该菌的外膜蛋白并与其功能性多肽位点结合，阻止牙龈卟啉单胞菌在牙周组织的定植，有效地降低牙龈素的水解活性，减小对细胞基质的破坏。抗牙龈卟啉单胞菌IgY被认为是治疗牙周炎的新型有效制剂。此外，他们还用牙龈卟啉单胞菌免疫 5 个月龄的白来杭鸡，将所获取的 IgY 制成质量分数为 20%的软膏用于洁刮治和根面平整后的牙周炎患者，结果使用该软膏患者的临床症状和牙龈卟啉单胞菌的数量都好于未使用者 [25] 。该研究是利用牙龈卟啉单胞菌进行被动免疫治疗牙周炎的重大尝试和进步。

3 结语

       从理论上讲，用致病菌的有效免疫抗原作为疫苗来防治牙周炎是可行的。鸡蛋中的抗体含量远远高于其他哺乳动物的血清，鉴于其安全性、生物学优势和制备简便，在试剂制备、疾病防治方面已经引起了较多学者的关注。牙龈卟啉单胞菌是牙周病的主要优势菌之一，将抗牙龈卟啉单胞菌 IgY 制备成药剂用于牙周炎的免疫防治，在被动免疫防治牙周炎领域具有良好的前景。

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（本文编辑 刘世平）